樣本間的變異性影響eDNA定量，并對(duì)估計(jì)生物多樣性有重要意義

主題
基于環(huán)境DNA（eDNA）的監(jiān)測(cè)已成為水域系統(tǒng)生物多樣性調(diào)查的成熟且高效的方法。然而，需要比較和標(biāo)準(zhǔn)化不同生態(tài)系統(tǒng)類(lèi)型的采樣方法，尤其是像河口這樣復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，因?yàn)榄h(huán)境因素波動(dòng)導(dǎo)致監(jiān)測(cè)魚(yú)類(lèi)種群存在獨(dú)特挑戰(zhàn)。本文比較了利用四種不同eDNA過(guò)濾方法從eDNA元條碼數(shù)據(jù)中獲得的物種豐富度：三種不同孔徑（0.45、1.2和5微米）的手工過(guò)濾方法，以及一種新建立的被動(dòng)方法——宏探針。該研究在一個(gè)超潮汐河口生態(tài)系統(tǒng)的鹽度梯度中進(jìn)行。總體而言，四種方法共檢測(cè)到44種魚(yú)類(lèi)。0.45微米濾波器回收了最高的豐富度（39個(gè)物種），其次是超探針?lè)ǎ?5個(gè)），再到1.2微米（34個(gè)）和5微米（33個(gè)）濾波器。鹽度梯度間的濾光性能顯示，0.45微米和1.2微米方法在所有采樣區(qū)域中恢復(fù)了最高的物種豐富度。0.45微米在使用各區(qū)域代表物種時(shí)，檢測(cè)概率也最為一致。雖然0.45微米方法似乎是最優(yōu)方法，但每種方法都可以被視為在河口和河流等動(dòng)態(tài)生態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行生物監(jiān)測(cè)的可行且可比的選擇。特別是，首次在淡水系統(tǒng)中使用的被動(dòng)元探針表現(xiàn)優(yōu)于手動(dòng)過(guò)濾方法，盡管部署時(shí)間較短。本研究為利用eDNA基因形態(tài)編碼優(yōu)化河口生態(tài)系統(tǒng)中的魚(yú)類(lèi)多樣性評(píng)估提供了關(guān)鍵見(jiàn)解，為未來(lái)全球類(lèi)似系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)工作提供了寶貴框架。

1 簡(jiǎn)介
在復(fù)雜環(huán)境中監(jiān)測(cè)生物，如河口系統(tǒng)中的魚(yú)類(lèi)，帶來(lái)了不同采樣方法帶來(lái)的挑戰(zhàn)（Alenzi 2024）。傳統(tǒng)魚(yú)類(lèi)監(jiān)測(cè)依賴(lài)于捕獲、目視識(shí)別和計(jì)數(shù)標(biāo)本（Radinger 等，2019;Franco 等，2022），采用了鰓網(wǎng)/圍網(wǎng)捕撈、電網(wǎng)捕撈、束流拖網(wǎng)和休閑釣魚(yú)等方法（Magaju 等，2023;Baldino等，2018年），以及較少危害的方法，如潛網(wǎng)捕撈（Collas等，2021年）。然而，這些方法具有侵入性，且實(shí)施成本高昂。基于DNA的方法的應(yīng)用，特別是環(huán)境DNA（eDNA）元條碼——即同時(shí)擴(kuò)增/測(cè)序多個(gè)物種的DNA——已成為監(jiān)測(cè)生物多樣性的成熟且高效的方法（Taberlet等，2012;奧格登 2022）。eDNA元條形編碼作為監(jiān)測(cè)工具的價(jià)值在全球多種水生生態(tài)系統(tǒng)中得到了充分證明（Rees等，2014;McDevitt 等，2019;Valentin 等，2020;Sales等，2021）。

然而，電子DNA監(jiān)測(cè)并非沒(méi)有挑戰(zhàn)，尤其是在河口采樣時(shí)，河口具有復(fù)雜的混合動(dòng)力學(xué)和密度梯度（Sanches和Schreier 2020;DiBattista 等，2022）。與海洋、湖泊和河流水質(zhì)較為均勻不同，河口涵蓋了海洋和淡水。這導(dǎo)致鹽度梯度強(qiáng)烈且變化大，并有大量再懸浮沉積物（Williams等，2017）。捕捉eDNA最常用的工具是包裹在塑料濾芯內(nèi)的過(guò)濾膜，連接手動(dòng)或機(jī)械注射器/泵，強(qiáng)行將水通過(guò)膜（Deiner等，2015;Miya等，2016;Capo等，2020）。這些濾紙有不同孔徑，即膜表面微孔大小，單位為微米（μm）。這些孔徑允許水通過(guò)，同時(shí)捕捉膜表面的遺傳物質(zhì)。eDNA研究常用的孔徑范圍為0.22至5微米（Turner等，2014;Thomas 等，2018）。在河口采樣eDNA的一個(gè)復(fù)雜問(wèn)題是重浮沉積物的含量，這可能導(dǎo)致這些過(guò)濾器迅速堵塞（Williams等，2017;Sanches 和 Schreier 2020）。較大的孔隙預(yù)計(jì)會(huì)減少堵塞，從而過(guò)濾更多水。然而，這并不一定會(huì)帶來(lái)更高的DNA產(chǎn)量（Kumar等，2022），因?yàn)檩^小的DNA片段可能無(wú)法被保留（Jo等，2022）。

雖然存在電子DNA采樣的標(biāo)準(zhǔn)化指南（例如，Bruce等，2021），但它們相對(duì)有限（Hirsch等，2024），且在濾膜堵塞仍是關(guān)鍵限制的環(huán)境中調(diào)整這些協(xié)議仍存在挑戰(zhàn)（Sanches和Schreier，2020）。當(dāng)前的解決方案，如自動(dòng)探針或多重過(guò)濾器池化（Hunter 等，2019;Hendricks 等，2023），對(duì)于大規(guī)模或資源有限的監(jiān)測(cè)項(xiàng)目來(lái)說(shuō)，成本可能過(guò)高，并且可能限制基于eDNA的監(jiān)測(cè)的普及。為避免手工過(guò)濾和濾網(wǎng)堵塞帶來(lái)的挑戰(zhàn)，有人提出使用被動(dòng)采樣器（Bessey 等，2021）。這涉及在水源中放置吸收材料，然后在不同時(shí)間范圍內(nèi)被動(dòng)積累電子DNA顆粒（Jeunen等，2022;Verdier 等，2022;Chen 等，2024）。最近，一種新的被動(dòng)采樣器——元探針，提供了與更傳統(tǒng)過(guò)濾方法相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果（例如0.2微米濾波器;Maiello 等，2022,2024）。 然而，其效率尚未在河口或淡水環(huán)境中進(jìn)行評(píng)估，且僅部署于海洋環(huán)境中，通常置于漁網(wǎng)內(nèi)并從漁船拋出（Maiello 等，2024;Sbrana 等，2024）。

本研究旨在優(yōu)化eDNA元條碼作為監(jiān)測(cè)工具，評(píng)估河口生態(tài)系統(tǒng)中魚(yú)類(lèi)生物多樣性，以默西河口為案例。默西河口位于英格蘭西北部（見(jiàn)圖1），其特點(diǎn)是強(qiáng)烈的潮汐力（Bowden 1963），導(dǎo)致高湍流和沉積物重新懸浮。歷史上，這里曾支持著生態(tài)和經(jīng)濟(jì)上具有重要性、現(xiàn)已受保護(hù)物種的繁榮種群，包括大西洋鮭魚(yú)（Salmo salar）、歐洲鰻魚(yú)（Anguilla anguilla）、銀魚(yú)（Osmerus eperlanus）、七鰓鰻（Lampetra sp. 和 Petromyzon marinus）以及褐鱒（Salmo trutta）（聯(lián)合自然保護(hù)委員會(huì) 2007）).然而，19世紀(jì)和20世紀(jì)的工業(yè)污染導(dǎo)致棲息地嚴(yán)重退化，使其數(shù)十年來(lái)生物貧瘠（Jones 2000， 2006）。近期的恢復(fù)舉措帶來(lái)了顯著的生態(tài)改善（Kim 和 Batey 2021），在長(zhǎng)時(shí)間缺席后，仍有顯著的大西洋鮭魚(yú)及其他物種被目擊（Mawle 和 Milner 2003;瓊斯 2006;Buysse 等人，2008;Ikediashi 等，2012）。這里，我們比較了4種過(guò)濾方法（0.45、1.2、5微米及超探針），覆蓋河口下游（海洋）、中部（半咸水）和上游（淡水）三個(gè)站點(diǎn)。這些區(qū)具有明顯的物理化學(xué)梯度，使我們能夠評(píng)估過(guò)濾性能隨環(huán)境條件的變化，并將為未來(lái)全球河口生物多樣性監(jiān)測(cè)的eDNA采樣策略提供參考。


圖1
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幻燈塔
默西河口的采樣點(diǎn)：上游區(qū)三個(gè)（橙色菱形），四個(gè)中部區(qū)（粉色圓圈），三個(gè)下區(qū)（藍(lán)色三角形）。
2 方法與材料
2.1 學(xué)習(xí)區(qū)
默西河口從沃靈頓附近的上潮限延伸至愛(ài)爾蘭海的利物浦灣，全長(zhǎng)約60公里（見(jiàn)圖1）。該河口為超潮汐區(qū)，春季潮汐在河口處為~10米（在小潮時(shí)為~4米），為半晝性，每天有兩次類(lèi)似的潮汐周期（Lane 2004）。來(lái)自愛(ài)爾蘭海的咸水與淡水輸入混合，主要來(lái)自默西河，該河長(zhǎng)期平均流量為37米3/秒（立方米每秒）。低流量條件，以Q95為代表（流量超過(guò)95%），平均9.4米3每秒，而高流量條件（Q5，超過(guò)5%的時(shí)刻）可達(dá)93米3/s（國(guó)家河流流量檔案2024）。這些動(dòng)態(tài)形成了一個(gè)高度活躍、混合良好的河口，形成了沿河岸連續(xù)體的物種分布結(jié)構(gòu)（Elliott 和 McLusky 2002）。

本研究選取了河口北岸的10個(gè)采樣點(diǎn)，涵蓋系統(tǒng)內(nèi)三個(gè)不同區(qū)域。在河口上游主要是淡水區(qū)，采樣了三個(gè)地點(diǎn)（U1、U2和U3）。河口中心區(qū)域形成河口濁度極大值（ETM），即沉積物湍流再懸浮導(dǎo)致的最高濁度區(qū)（Geyer 1993）。該區(qū)形成了大型混合區(qū)，海水與淡水匯聚。總共選定了四個(gè)采樣點(diǎn)（C1、C2、C3和C4），因?yàn)樵搮^(qū)域更為突出（寬度約5公里），且因ETM帶來(lái)的復(fù)雜性增加。下游河口主要是海洋區(qū)，另有三個(gè)樣本點(diǎn)被指定（L1、L2和L3;圖1）。

2.2 電子DNA過(guò)濾方法
評(píng)估了四種不同的方法：孔徑為0.45微米（Sterivex）、1.2微米（Whatman）、5微米（KX尼龍）的注射器過(guò)濾器，以及一種被動(dòng)方法——超探針（見(jiàn)圖S1）。樣本于2022年11月、12月及2023年1月間，每月三天采集，漲潮時(shí)每天3至4個(gè)采樣點(diǎn)，因多個(gè)采樣點(diǎn)在退潮時(shí)常干燥。每個(gè)月，每種方法在10個(gè)站點(diǎn)各采集三次重復(fù)樣本，實(shí)驗(yàn)中共收集了360個(gè)eDNA樣本。使用注射器過(guò)濾器的三種方法中，水樣采集于單個(gè)1升消毒桶中，每次復(fù)制使用一個(gè)桶。每個(gè)采樣日開(kāi)始時(shí)，使用密封瓶裝水采集一次1升田間空白水復(fù)制樣本。每個(gè)注射器過(guò)濾器都使用60毫升注射器手動(dòng)將水通過(guò)過(guò)濾膜。采集后立即在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行水樣過(guò)濾。當(dāng)每個(gè)注射器濾芯的復(fù)制品堵塞到無(wú)法再推水時(shí)，記錄過(guò)濾的體積（表S4–S6），濾芯被密封在一個(gè)無(wú)菌氣密袋中，并在實(shí)驗(yàn)室中保存至?20°C，直到處理完成。異次探針?lè)椒ㄔ谒_爾福德大學(xué)專(zhuān)門(mén)的eDNA潔凈室中制備，隨后進(jìn)行田野調(diào)查。單卷（三卷代表三個(gè)復(fù)制品）尺寸相同（10×10厘米）醫(yī)用紗布被固定在超探針球內(nèi)壁，并用消毒過(guò)的鋼帶固定。每個(gè)超探針準(zhǔn)備三根含有99%乙醇的50毫升Falcon管，用于取樣后儲(chǔ)存紗布。準(zhǔn)備好的超探針和獵鷹管被密封在無(wú)菌袋中，直到部署到各自采樣點(diǎn)，即注射器過(guò)濾方法完成后立即部署。變探針通過(guò)快掛掛在20米長(zhǎng)的繩索上（見(jiàn)圖S2），并在每個(gè)地點(diǎn)拋入水中5分鐘。在展開(kāi)超探針之前，在每個(gè)采樣日開(kāi)始時(shí)，將單場(chǎng)空白紗布置于含99%乙醇的Falcon管中。部署后立即，將超探針小心切開(kāi)，每卷紗布放入預(yù)先準(zhǔn)備好的獨(dú)立Falcon管中，并在?20°C下保存直到提取DNA。5分鐘時(shí)長(zhǎng)是基于其他方法中過(guò)濾一次復(fù)制的平均時(shí)間確定的，因此在所有測(cè)試方法中實(shí)現(xiàn)了相同的抽樣時(shí)長(zhǎng)。

2.3 DNA提取與擴(kuò)增
所有DNA提取均在專(zhuān)用eDNA潔凈室內(nèi)進(jìn)行，并由佩戴全套個(gè)人防護(hù)裝備（如工裝、手套、發(fā)網(wǎng)、口罩和一次性靴子）的人員在提取前至少6小時(shí)通過(guò)紫外線進(jìn)行消毒。DNA提取遵循Mu-DNA協(xié)議（Sellers等，2018），該方案針對(duì)注射器過(guò)濾方法的水樣和超探針過(guò)濾法的土壤樣本量身定制。選擇土壤提取方法是為了考慮元探針的獨(dú)特特性，即其收集和積累顆粒物（通常懸浮的沉積物），使樣本組成更接近土壤。共處理了360份eDNA樣本和36個(gè)陰性對(duì)照組，包括現(xiàn)場(chǎng)和實(shí)驗(yàn)室空白樣本。

測(cè)試了兩種不同的引物集：MiFish-U/E 和 Tele02。MiFish-U/E 引物靶向 12S rRNA 基因的超變區(qū)（163–185 堿基），在淡水環(huán)境中被廣泛應(yīng)用（Miya 等，2015）;Tele02 引物擴(kuò)增 12S 基因中約 167 堿基對(duì)的片段，專(zhuān)門(mén)針對(duì)硬骨魚(yú)（Taberlet 等，2018）。雖然兩種引物均成功擴(kuò)增了目標(biāo)基因區(qū)域，但MiFish引物在半咸水和海水樣本（即中部和下區(qū)采集的樣本）中，擴(kuò)增的是來(lái)源不明的非目標(biāo)片段（見(jiàn)圖S3A），而Tele02引物主要擴(kuò)增魚(yú)類(lèi)特異性靶點(diǎn)片段（見(jiàn)圖S3B）。由于與MiFish引物在所有采樣區(qū)的引物不一致，提取的DNA使用魚(yú)類(lèi)特異性Tele02引物進(jìn)行擴(kuò)增（Taberlet等，2018）。為考慮可能的標(biāo)簽跳躍和污染，包含了陽(yáng)性（Hoplias malabaricus，一種新熱帶淡水物種）和陰性PCR對(duì)照（即使用無(wú)核酸酶水而非eDNA）的PCR反應(yīng)。

PCR在六個(gè)平衡平衡的文庫(kù)中制備（90卷紗布——每個(gè)文庫(kù)15卷，270卷注射器濾紙樣本——每個(gè)文庫(kù)45個(gè)，12個(gè)現(xiàn)場(chǎng)空白樣本——每個(gè)文庫(kù)2個(gè)，12個(gè)提取空白文庫(kù)（每個(gè)文庫(kù)2個(gè)），12個(gè)PCR陰性對(duì)照組（每個(gè)文庫(kù)2個(gè)），12個(gè)PCR陽(yáng)性對(duì)照組（每個(gè)文庫(kù)2個(gè);每個(gè)文庫(kù)共68個(gè)樣本），每個(gè)文庫(kù)三份PCR進(jìn)行。每個(gè)樣本均使用Teleo02引物擴(kuò)增，包括一個(gè)獨(dú)特的8堿基對(duì)寡果標(biāo)簽，連接在正反引子上，以及可變數(shù)量（2–4）的前導(dǎo)N（完全簡(jiǎn)并位置），以增加擴(kuò)增子序列的變異性。采用單步協(xié)議進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以最大限度減少單個(gè)反應(yīng)的偏倚。PCR反應(yīng)總體積為20微升，其中包括10微升AmpliTaq金360主混合液（1X;應(yīng)用生物系統(tǒng)）、0.16微升BSA（20 mg/mL）、兩種引物各1微升（5微米）、5.84微升超純水和2微升eDNA模板。所有文庫(kù)的PCR擴(kuò)增均在以下熱循環(huán)條件下進(jìn)行：95°C持續(xù)10分鐘，隨后95°C循環(huán)40次30秒，60°C循環(huán)45秒，72°C循環(huán)30秒，最終延長(zhǎng)72°C循環(huán)5分鐘。

隨后將復(fù)制體合并，并將樣品置于涂有GelRed染色的1.2%瓊脂糖凝膠上，以檢測(cè)靶片是否成功擴(kuò)增。隨后用HighPrep PCR凈化系統(tǒng)磁珠純化PCR產(chǎn)品，左側(cè)尺寸選擇時(shí)采用1.1×比。純化后的文庫(kù)在安捷倫2200 TapeStation上使用高靈敏度D1000屏幕帶（安捷倫科技）進(jìn)行可視化。這表明靶片段右側(cè)存在次級(jí)非靶產(chǎn)物，通過(guò)右側(cè)尺寸選擇（所有文庫(kù)的比值為0.8×）被去除。

通過(guò)Qubit dsDNA HS測(cè)定套件（Invitrogen）使用Qubit 4.0熒光儀定量了選定的DNA。基于總DNA濃度，每個(gè)文庫(kù)被稀釋至20 ng/μL，體積為50 μL以制備文庫(kù)。端修復(fù)、適配器連接和文庫(kù)PCR擴(kuò)增均使用KAPA HyperPrep Kit，按照制造商協(xié)議完成。文庫(kù)通過(guò)定量PCR（qPCR）在MIC qPCR系統(tǒng)（生物分子系統(tǒng)）上，使用NEBNext庫(kù)定量套件（Illumina，新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室）進(jìn)行定量定量。庫(kù)1和2、3和4以及5和6被按等摩爾濃度合并，形成了最后三個(gè)庫(kù)。所有文庫(kù)均在晚上9點(diǎn)（共3次測(cè)序運(yùn)行）在Illumina MiSeq Reagent v2（300周期）試劑套件（Illumina Inc.）上測(cè)序。